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Atualizado em 27 de junho de 2026 – por Isadora Restum

Guia passo a passo para subcultivo de células aderentes em monocamada usando tripsinização.

A passagem celular (também chamada de repique ou subcultivo) é a transferência de uma fração das células de uma cultura confluente para um novo frasco com meio fresco. Isso evita a superpopulação, a exaustão de nutrientes e a perda de viabilidade, mantendo as células saudáveis e em crescimento exponencial. O protocolo abaixo descreve o método clássico para linhagens aderentes usando tripsina-EDTA.

1. Materiais e Reagentes

Separe e organize tudo dentro da cabine antes de iniciar. Aqueça os reagentes líquidos a 37 °C em banho-maria.

Item	Observação
Meio de Cultura Completo	DMEM + 10% SFB, pré-aquecido a 37 °C
PBS Estéril	Para lavagem da monocamada
Tripsina-EDTA 0,25%	Pré-aquecida; agente de dissociação
Garrafas de cultura novas e estéreis	Devem estar identificados com linhagem, passagem, data e autoria
Pipetas sorológicas e pipetador	Estéreis e descartáveis
Tubos Falcon	Para centrifugação
Câmara de Neubauer + azul de tripan	Contagem e viabilidade celular
Microscópio invertido	Avaliar confluência e desprendimento
Centrífuga, estufa de CO₂ (37 °C, 5% CO₂), banho-maria	Equipamentos de apoio

2. Preparação

1. Higienize as mãos, vista os EPIs e ligue a cabine de fluxo laminar com antecedência (≈15 min) para estabilizar o fluxo de ar.
2. Borrife etanol 70% nas superfícies internas da cabine e em tudo que entrar nela.
3. Aqueça meio completo, PBS e tripsina-EDTA a 37 °C no banho-maria. Não deixe a tripsina aquecida por tempo prolongado, pois ela perde atividade.
4. Ao microscópio invertido, confirme que a cultura está ~80–90% confluente e sem sinais de contaminação.

3. Remoção do meio e lavagem

1. Aspire cuidadosamente o meio de cultura antigo, sem encostar a ponta da pipeta na monocamada.
2. Adicione PBS estéril pela parede do frasco (~ 2–3 mL), incline suavemente para lavar e remova. Essa lavagem retira soro residual, que inibe a tripsina.
3. Repita a lavagem se a linhagem produzir muita matriz ou se houver muito soro residual.

4. Tripsinização

1. Adicione tripsina-EDTA em volume suficiente para cobrir a monocamada (~ 1-2 mL). Incline para distribuir uniformemente.
2. Incube a 37 °C por 5 minutos. Evite tempo excessivo, pois a tripsina em excesso danifica a membrana celular.
3. Após 5 minutos, bata na lateral do frasco para auxiliar o desprendimento das células. É observável que as células estão desprendendo quando o meio começar a se tornar turvo.
4. Assim que a maioria das células estiver solta, neutralize a tripsina adicionando o dobro do volume de PBS.
5. Lave a superfície com a própria suspensão para recolher as células remanescentes e desfazer grumos.

5. Centrifugação

1. Transfira a suspensão para um tubo falcon de 15 mL ou 50 mL.
2. Centrifugue a 1.500 g por 6 minutos à temperatura ambiente.
3. Ao final da centrifugação, vire o tubo falcon no descarte rapidamente, sem perturbar o pellet de células no fundo.
4. Ressuspenda o pellet em um volume conhecido de meio completo fresco até homogeneizar.

6. Contagem e Viabilidade

1. Misture 10 µL da suspensão com 10 µL de azul de tripan (diluição 1:2).
2. Carregue a câmara de Neubauer e conte as células nos 4 quadrantes externos ao microscópio. Células azuis = mortas; brilhantes/incolores = vivas.
3. Calcule a concentração:

   células / mL = (média de células por quadrante) × fator de diluição × 10⁴

4. Estime a viabilidade (%) = (células vivas ÷ células totais) × 100. Ideal > 90%.

7. Semeadura no Novo Frasco

1. Adicione um meio completo fresco ao novo frasco e o volume calculado de células.
2. Homogeneíze com movimentos suaves em forma de "8" para distribuir uniformemente as células.
3. Identifique o frasco com linhagem, número da passagem, data e autoria.
4. Incube a 37 °C e 5% CO₂. Verifique a adesão e a confluência nas próximas 24–48 h.

8. Solução de Problemas

• Células não soltam: tripsina fria ou inativa, soro residual ou tempo curto demais. Lave melhor a garrafa com PBS e aqueça a tripsina.
• Muitas células mortas: tripsinização longa demais ou pipetagem agressiva.
• Grumos: necessidade de ressuspender de forma mais homogênea.
• Crescimento lento após o repique: densidade de semeadura baixa ou passagem muito alta.
• Contaminação: necessário o descarte conforme as normas de biossegurança e revisão da técnica asséptica.

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Aviso: este protocolo é um material de estudo/modelo de bancada. Adapte volumes, tempos e razões de divisão ao SOP do seu laboratório e à linhagem celular específica.